Characterising the formation and functional role of vesicular clustering during Influenza A virus infection

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Os vírus Influenza, que pertencem à família Orthomyxoviridae, estão divididos em quatro tipos A, B, C e D (Hause et al. 2013; Hause et al. 2014). Entre estes, o influenza A (IAV) é o vírus que causa maior impacto na saúde pública. O seu reservatório natural são as aves marinhas, no entanto possui a capacidade de gerar infeções zoonóticas encontrando-se disseminado em muitas espécies de aves e mamíferos (Acheson 2011; Taubenberger & Kash 2010). Nos seres humanos, o IAV é o patógeno responsável pela gripe, uma doença aguda respiratória associada a alta morbidade e mortalidade (Lofgren et al. 2007). O IAV é composto por um invólucro viral derivado da membrana plasmática da célula. Este envelope é revestido por uma camada externa de proteínas virais, designadamente hemaglutinina e neuraminidase. O interior do virião contém o genoma viral, constituído por oito complexos ribonucleoproteicos (vRNPs). Cada vRNP é composto por um dos oito segmentos de ácido ribonucleico viral que codificam para diferentes proteínas virais. Os vRNPs funcionam como unidades independentes sendo necessário um conjunto completo de oito vRNPs diferentes para a montagem de uma partícula infeciosa (Fields et al. 2007). Os vRNPs são transportadas por piggyback em vesículas destinadas à periferia da célula através da interação entre a polimerase 2 viral e a GTPase Ras related in brain 11 (Rab11) (Amorim et al. 2011; Eisfeld et al. 2011; Momose et al. 2011). Em homeostasia, o Rab11 está envolvido na reciclagem de proteínas endocitadas. Regula a formação, movimento e fusão de vesículas originárias do compartimento de reciclagem de endossomas e encontra-se espalhado pelo citoplasma (Grant & Donaldson 2009). Em células infetadas, o Rab11 acumula no citoplasma formando agregados vesiculares. Sabe-se que estas vesículas são heterogéneas, compostas por membrana simples e dupla (SMV e DMV, respetivamente), o que indica que o IAV conduz não só ao agrupamento vesicular mas também ao rearranjo das suas membranas (Vale-Costa et al. 2016). Este trabalho permitiu fundamentar um modelo alternativo para a montagem genómica do IAV, em que o agrupamento vesicular pode funcionar como uma plataforma induzida pelo virus para a criação de hotspots de vRNPs. A alta co-localização entre o conjunto de todas as vRNPs permitiria a ocorrência das interações RNA-RNA necessárias à junção do genoma completo composto pelos oito vRNPs. O agrupamento vesicular surge assim como um passo essencial no ciclo replicativo do IAV. Pelo que, a definição da cronologia de eventos que levam à sua maturação e as alterações na composição vesicular tornam-se fundamentais para compreender os mecanismos de montagem genómica do IAV. Neste trabalho experimental foi aplicada uma multi-metodologia de crio-microscopia eletrónica (EM). A razão da escolha dos métodos de crio-EM baseia-se na capacidade que estas técnicas têm para preservar os detalhes ultra-estruturais sem introduzirem os artefactos morfológicos de volume, forma e desnaturação de epitopos associados aos métodos cuja abordagem é puramente química (Studer et al. 1989). No entanto, para a sua aplicação, estes métodos tiveram que sofrer otimizações. Os mesmos permitiram elucidar o modo como a agregação vesicular se forma em células A549 que expressam constitutivamente GFP-Rab11 durante a infeção e qual a função das vesículas agregadas no ciclo replicativo do IAV. A metodologia de crio-EM usada incorporou duas técnicas conhecidas na área: a técnica de congelamento de alta pressão e de fixação química por substituição a baixas temperaturas e a técnica de Tokuyasu. A primeira utiliza a baixa temperatura do azoto (-196ºC) e alta pressão (aproximadamente 2000 bar) para crio-imobilizar as amostras. A técnica permitiu a preservação celular para análise morfológica e a quantificação vesicular (sem introdução de artefactos de fixação química). A segunda técnica, Tokuyasu, também tira partido da baixa temperatura do azoto para crio-imobilizar as amostras e permite manter as estruturas hidratadas para uma imunomarcação ótima. Esta técnica foi usada para discernir a origem das estruturas vesiculares em estudo. As metodologias usadas neste trabalho foram alvo de diversas otimizações, com o intuito de preservar as características ultra-estruturais o mais próximo possível do seu estado nativo (McDonald 2007). Na otimização da técnica de congelamento de alta pressão dois parâmetros foram avaliados: a vitrificação e a preservação morfológica das células GFP-Rab11. A vitrificação refere-se ao processo de transformação de um liquido em sólido sem cristalização. A cristalização induz artefactos nas células, reconhecíveis sob a forma de redes interligadas de espaços vazios onde outrora expandiram os cristais de gelo. Ambos os parâmetros de vitrificação e preservação morfológica são afetados pelo tipo de suporte de amostra utilizado para congelar, bem como pelo tipo de enchimento escolhido para preencher o espaço livre entre a amostra e o suporte. Os tipos de suporte para congelamento de amostras testados foram os discos planos e os suportes côncavos. O primeiro tipo – discos planos - permite o congelamento de células em camada única e foi testado em combinação com três tipos de enchimentos (hexadeceno, dextano a 20% (m/v) e albumina sérica bovina a 20% (m/v)). O segundo tipo – suportes côncavos – permite o congelamento em pellet e foram testados em combinação com hexadeceno. Estabeleceu-se que o melhor protocolo para processamento de células GFP-Rab11 por congelamento de alta pressão tendo em conta o objeto de estudo (a ultra-estrutura vesicular) foi alcançada ao usar a combinação de discos planos com hexadeceno. Para a otimização da técnica de Tokuyasu, quatro marcadores: Golgi Marker (GM) 130, calnexina, nucleoproteína (NP) e GFP-Rab11 foram estudados em células infetadas com IAV para a capacidade de manter sua imunorreatividade em diferentes condições de fixação. Três fixadores foram usados durante o teste: formaldeído a 2% (v/v) com glutaraldeído a 0,2%, 0,1% e 0,05% (v/v). Como controlo foi adicionado o fixador de referência em imunocitoquímica: formaldeído a 4% (v/v). O formaldeído permite a manutenção da imunorreatividade celular, no entanto o glutaraldeído conduz a uma melhor preservação morfológica da ultra-estrutura. O fixador que permitiu a preservação da imunorreatividade de todos os marcadores foi o formaldeído a 4% (v/v) e, como tal, o fixador usado no estudo. A combinação entre as técnicas de crio-EM, congelação por alta pressão e Tokuyasu, permitiu quantificar o número de vesículas de membrana simples e dupla (SMV e DMV, respetivamente) durante a infeção por IAV. Foi possível determinar que o número de SMVs - utilizadas como veículos para o transporte de vRNPs - aumenta durante a infeção por IAV e que as membranas destas vesiculas de membrana simples são reorganizadas para produzir as DMVs. Desta forma, é possível afirmar que as SMV juntamente com as DMVs parecem constituir os agregados vesiculares formados durante a infeção e que permitem a convergência espacial dos vRNPs. Para além das técnicas de crio-EM descritas, também a técnica de correlação entre microscopia de luz e eletrónica (CLEM) foi desenvolvida e otimizada para pesquisa da função dos agregados vesiculares. A técnica de CLEM aplicada combinou as técnicas de hibridização in situ fluorescente (FISH), microscopia estocástica de reconstrução ótica (STORM) e EM e contribuiu para uma caracterização adicional do papel das SMVs e das DMVs dentro dos agregados. A técnica FISH em conjunto com a técnica de STORM permitiu a identificação específica de segmentos do genoma do IAV em agregados de Rab11, enquanto a EM forneceu o contexto ultra-estrutural da célula. No entanto, a precisão da correlação alcançada foi baixa, não tendo permitido a identificação do conteúdo genómico transportado por cada vesícula dentro dos agregados. Neste sentido, podemos afirmar que, apesar de poder ser combinada com outras técnicas, a técnica de CLEM integrando FISH, STORM e EM é uma técnica ainda em desenvolvimento e que requer melhorias adicionais. Em resumo, o trabalho aqui descrito conduziu à conclusão de que as vesículas de membrana simples e dupla, portadoras de vRNPs, são originárias do compartimento de reciclagem de endossomas. Ambos os tipos de vesículas foram encontrados nos agregados e identificadas com os mesmos marcadores imunes. A sua relevância funcional para a montagem dos vRNPs continua por inferir, sendo necessária a contínua otimização da combinação das técnicas de microscopia de luz e de microscopia eletrónica para determinar um método de CLEM funcional.Influenza viruses, from the Orthomyxoviridae family, are divided in four types A, B, C and D (Hause et al. 2013; Hause et al. 2014). Influenza A (IAV) as the capacity to generate zoonotic infections and is widespread in many mammalian and avian species. (Acheson 2011; Taubenberger & Kash 2010). In humans, IAV is the pathogen responsible for flu, a respiratory acute disease associated with high morbidity and mortality (Lofgren et al. 2007). IAV as a segmented genome divided in eight different viral ribonucleoprotein complexes (vRNP). Each vRNP complex is composed by one of the eight viral ribonucleic acid segments. The vRNPs function as independent units and a complete set of eight different vRNPs is required for assembly of an infectious IAV particle (Fields et al. 2007). It is known that vRNPs are transported by piggybacking in vesicles destined to the cell periphery via interaction between the viral polymerase basic protein 2 and the host GTPase Ras-related in brain 11 (Rab11) (Amorim et al. 2011; Eisfeld et al. 2011; Momose et al. 2011). Also, it was stated that during infection there is an aggregation of vesicles creating clusters. The clusters were composed by vesicles with single and double membranes (SMV and DMV), indicating that IAV leads not only to clustering but also to the rearrangement of vesicular membranes (Vale-Costa et al. 2016). This work substantiated an alternative model for IAV genomic assembly in which vesicular clustering can function as a viral induced platform promoting the creation of vRNPs hotspots. The high co-localization among the pool of all vRNPs would allow the establishment (or completion) of the RNA-RNA interactions necessary for assembly of the eight RNA segments before budding. Vesicular clustering thus emerges as an essential step in IAV lifecycle. In this work, a multi electron microscopy (EM) cryo-methodology was not just applied but also optimized and developed to elucidate how vesicular clustering is formed in A549 cells constitutively expressing GFP-Rab11 during infection and what the vesicles functional role in the lifecycle of IAV. The EM cryo-methodology incorporated the High Pressure Freezing – Freeze Substitution (HPF-FS) and Tokuyasu techniques. The first permitted the morphological analysis of cells and vesicular quantification (without introducing chemical fixation artifacts) and the second enabled the immunolabeling of structures to discern their origin. Also, to further investigate the functional role of clusters a correlative light electron microscopy (CLEM) method that combines Fluorescent in situ Hybridization (FISH), Stochastic Optical Reconstruction microscopy (STORM) and EM was developed. The optimization of HPF-FS technique established that the best vitrification and morphological preservation of GFP-Rab11 cells was achieved when using flat disks, as specimen carriers for the freezing process, filled with 1-hexadecene, as a cryoprotectant. For Tokuyasu, 4% (v/v) formaldehyde was the fixative to enable the best preservation of immunoreactivity. Together, both techniques, lead to conjecture that the number of SMVs - used as vehicles for vRNP trafficking - increase during IAV infection and are modified to rearrange membranes and produce DMVs. Both Rab11 SMVs and DMVs seem to constitute the clusters formed during infection that enable the spatial convergence of vRNPs. The CLEM technique incorporating FISH, STORM and EM contributed to a further characterization of SMVs and DMVs role within the clusters. The FISH technique allowed the identification of IAV genome segments on Rab11 clusters imaged by STORM, whereas EM provided the ultrastructural context of the cell. A low accuracy of the achieved correlation did not allow the identification of the segment content of each vesicle within the clusters. This combinatorial but powerful method thus requires further improvement. In summary, the work herein described led to the conclusion that vesicles of single and double membrane, carrying vRNPs, originate from the endosomal recycling compartment. Both types of vesicles were found in clusters. Their functional relevance for vRNP assembly remains to be determined, as the CLEM method developed for its study needs further optimization

Patterns of rock pool molluscs in differing shore exposures

Rock pools are understudied systems of extreme importance due to their proven vulnerability to climate change. Rock pool molluscs play essential ecological roles therein, directly by acting both as prey and predator and, indirectly by influencing the macroalgal canopy/vegetation topography via grazing. However, the environmental factors driving their rock pool occupation remain largely unknown. Our study is one of the few to focus on community patterns in rock pool molluscs, particularly at a large scale between shores of differing exposure to wave action, being the first focused assessment of rock pool molluscs in Portugal. Overall, 32 intertidal rock pools on four rocky shores were studied during the summer spring tide of 2015. We used multivariate analysis to evaluate the potential impact of sheltered versus exposed wave action, physical pool structure (length, width, and depth), and relationships within the pool community on the abundance and diversity of molluscs. Wave exposure significantly influenced mollusc abundance and diversity. The majority of the 37 different taxa identified were grazing gastropods (62.2%), followed by bivalves (27.0%) and chitons (10.8%). We suggest that mollusc taxa may have preferences for particular rock pool habitats depending on the type of algae present rather than pool size. We also suggest that species-specific mollusc presence in rock pools can be related to their shell size, aperture, and foot size due to corresponding variation in musculature needed to hold the snail to the substrate in hydrodynamic conditions. Further investigation would benefit from disentangling the potential role of algal pool coverage as a refuge for molluscs.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A symbolic approach to nonlinearly perturbed heat equation

We consider a system described by the linear heat equation with adiabatic boundary conditions which is perturbed periodicaly. This perturbation is nonlinear and is characterized by a one-parameter family of quadratic maps. The system, depending on the parameters, presents very complex behaviour. We introduce a symbolic framework to analyze the system and resume its most important features

extração de bioativos

Tese de mestrado, Qualidade Alimentar e Saúde, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.As plantas halófitas são plantas tolerantes à salinidade, comestíveis e que se encontram por todo o mundo, inclusive em Portugal, ao longo da costa. Estas plantas possuem na sua constituição compostos fenólicos, que são antioxidantes naturais, e que têm sido apontados como responsáveis por alguns dos efeitos benéficos para a saúde do ser humano. Existem diversas espécies de plantas halófitas, no entanto, a mais conhecida e comercializada é a Salicornia ramosíssima. Dada a utilização cada vez mais importante deste tipo de plantas, justifica-se um estudo aprofundado sobre a sua composição e possíveis benefícios para a saúde. Para aumentar este conhecimento, há necessidade de otimizar metodologias de extração e análise que permitam ter uma informação detalhada sobre a composição destas plantas. Esta dissertação teve como principal objetivo extrair compostos bioativos de plantas halófitas, mais concretamente de S. ramosissima e caraterizar a sua composição química e bioatividade. Inicialmente realizou-se a caraterização da planta, onde foi possível identificar os compostos voláteis responsáveis pelo aroma das plantas presentes na sua composição, estudar o seu perfil lipídico e identificar e quantificar pigmentos e compostos fenólicos. Através desta caraterização verificou-se que a amostra, relativamente a compostos voláteis, possui maioritariamente álcoois (25%) e alcanos (27%), tendo também na sua composição compostos como o mentol (9.55%) e a cânfora (2.90%). Ao extrair o conteúdo lipídico da amostra foi possível identificar e quantificar os diferentes ácidos gordos presentes, sendo os maioritários o ácido alfa-linoleico (C18:3, 34%), o ácido linoleico (C18:2, 17%) e o ácido palmítico (C16, 21%). Possui carotenoides e clorofilas na sua composição. Relativamente a compostos fenólicos, foi possível identificar mais de 10 tipos diferentes, mas os maioritariamente presentes na planta são o ácido clorogénico e o quercetina-3-glucósido. Testaram-se depois diferentes técnicas de modo a extrair compostos bioativos utilizando-se técnicas convencionais – Soxhlet - e alternativas, como a extração por fluidos supercríticos, extração assistida por ultrassons e extração assistida por microondas. Com o auxílio de um programa estatístico, o MODDE, foi possível otimizar esta última extração. Ao comparar os resultados obtidos, concluiu-se que a extração assistida por microondas é o melhor método de extração uma vez que não consome muito tempo e energia, é um método relativamente simples e obtêm-se valores elevados de rendimento mássico e conteúdo fenólico total, 56.69% e 30.76 mg GAE/g extrato, respetivamente. Em suma, esta dissertação permitiu caraterizar a composição da Salicornia ramosissima e otimizar métodos de extração considerados “amigos do ambiente” para compostos bioativos.Halophyte plants are salinity tolerant plants, edible and found all over the world, including in Portugal, along the coast. These plants have in their constitution phenolic compounds, which are natural antioxidants, and which have been pointed out as responsible for some of the beneficial effects for the health of human being. There are several species of halophyte plants, however, the best known and marketed is the Salicornia ramosissima. Given the increasingly important use of this type of plants, an in-depth study on its composition and possible health benefits is warranted. To increase this knowledge, there is a need to optimize extraction and analysis methodologies that allow to obtain detailed information about the composition of these plants. The main objective of this dissertation is to extract bioactive compounds from halophyte plants, more specifically from S. ramosissima and characterizing its chemical composition and bioactivity. Initially the plant was characterized, where it was possible to identify the volatile compounds responsible for the aroma of plants present in its composition, study its lipid profile and identify and quantify pigments and phenolic compounds. Through this characterization it was found that, relatively to volatile compounds, the sample has mainly alcohols (25%), alkanes (27%), menthol (9.55%) and camphor (2.90%). By extracting the lipid content from the sample, it was possible to identify and quantify the different fatty acids present, with the majority being alpha-linoleic acid (C18:3, 34%), linoleic acid (C18:2, 17%) and palmitic acid (C16, 21%). It has carotenoids and chlorophylls in its composition. For phenolic compounds, it was possible to identify more than 10 different types, but the majority present in the plant is chlorogenic acid and quercetin-3-glucoside. Were then tested different techniques to extract bioactive compounds using conventional techniques – Soxhlet - and alternatives, such as supercritical fluid extraction, ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted extraction. With a statistical program, MODDE, it was possible to optimize this last extraction. When comparing the results obtained, it was concluded that microwave-assisted extraction is the best extraction method since it does not consume much time and energy, it is a relatively simple method and there were obtained high values of mass yield and total phenolic content, 56.69 % and 30.76 mg GAE/g extract, respectively. In conclusion, this dissertation allowed to characterize the composition of Salicornia ramosissima and optimize extraction methods considered "environmentally friendly" for bioactive compounds.iBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica

Muerte y pérdida de identidad : temor que despiertan en la sociedad castellana durante la Baja Edad Media

Uno de los modos de conocer las mentalidades de una sociedad es a través del análisis de sus sentimientos. Este estudio se centra en dos de los temores a los que se enfrentan los habitantes de Castilla en la Baja Edad Media, la muerte y la pérdida de identidad, a través de su relación y su proyección material, tanto literaria como iconográfica. El contexto temporal coincide con las transformaciones de la decimoquinta centuria, lo que supone un cambio en la concepción de estos dos aspectos de la vida y, por ende, del miedo que suscitan.One of the ways to approach the study of mentalities is through the analysis of human feelings. This study examines death and the loss of identity, two common fears in Castile in the Later Middle Ages, through their relationship and material expression, both literary and iconographic. Our focus will be on the fifteenth century, a time of deep transformations in which we encounter a shift in the meaning of these two aspects of life and, thus, of the fear they evoke

Estudo comparativo entre argamassas de cal calcítica e de cal dolomítica: caracteristicas mecânicas, físicas, mineraloógicas e microestruturais

São apresentados e discutidos os resultados de um estudo comparativo entre argamassas de cal aérea calcítica e dolomítica, com o objetivo de avaliar a influência da natureza e teor em ligante nas características mecânicas, físicas, mineralógicas e microestruturais, ao longo do tempo. Os resultados mostraram que as argamassas de cal dolomítica, comparativamente às de cal calcítica, apresentam resistências mais elevadas e têm um melhor comportamento à água. Verificou-se existir uma relação positiva entre o teor em ligante e as resistências mecânicas e à água. O processo de carbonatação, que influencia o comportamento mecânico e físico das argamassas, tem uma cinética mais lenta nas cais dolomíticas, atingindo a fase de estabilização por volta dos 28 dias no caso das argamassas de cal calcítica e dos 56 dias no caso das argamassas de cal dolomítica; Comparative study of calcitic and dolomitic lime mortars: mechanical, physical, mineralogical and microstructural characteristics ABSTRACT: It is presented and discussed the results of a comparative study between calcitic and dolomitic air lime mortars in order to evaluate the influence of the binder nature and binder/aggregate ratios in the mechanical, physical, mineralogical and microstructural characteristics, over time. The results show that dolomitic lime mortars present higher mechanical strength and better water resistance, compared to the calcitic lime mortars. It was shown that a positive relationship exists between the binder content and mechanical strength and water resistance. The process of carbonation, which influences the mortars mechanical and physical behavior, has a slower kinetics in dolomitic lime, reaching stabilization after around 28 days in the case of calcitic lime mortars, and 56 days in the case of dolomitic lime mortars

Prevenção da violência e da indisciplina em contexto escolar

Mestrado em Ciências da Educação - Educação Social e Intervenção ComunitáriaA problemática deste projecto, centrada na Prevenção da Violência e da Indisciplina em Contexto Escolar, resultou do trabalho desenvolvido com a comunidade da Escola Básica das Abelhinhas (designação fictícia). O seu objectivo principal consistiu na construção de conhecimento sobre a realidade em questão, de forma a criar mecanismos que permitissem combater e prevenir eventuais situações de violência e indisciplina. O método de investigação seleccionado foi a Investigação-Acção, uma vez que, para além de envolver os participantes do processo, pressupõe um carácter reflexivo e interventivo, permitindo introduzir alterações consoante as necessidades e visando uma melhoria na qualidade da educação. De forma a recolher dados pertinentes para o estudo em causa, foram utilizadas técnicas de observação directa, conversas informais, grupos de discussão focalizada, entrevista semi-estruturada, inquérito por questionário, aliadas a procedimentos diversos que visavam atingir o objectivo da prevenção dos comportamentos desviantes. Em linhas gerais, apontamos a existência de alguns conflitos e situações claras de indisciplina que justificavam um trabalho com o grupo participante no sentido da prevenção dessas problemáticas, procurando alternativas aos comportamentos desadequados. ABSTRACT: This project was focused on preventing violence and indiscipline in school as a result of the work carried out with the community of Escola Básica das Abelhinhas (fiction name). The main goal was to be aware of the reality in question as well as to create mechanisms that would help combat and prevent potential situations of violence and indiscipline. Accordingly, investigation-action research was the selected method, since it requires the involvement of the individuals in the investigation process itself, which has a reflexive and intervening nature, allowing modifications based on needs and aiming at improving the quality of education. In order to collect relevant data for the study in question, we have used direct observation, informal conversations, focus groups, interview, questionnaire surveys and analysis of content, combined with various strategies aimed at achieving the goal of preventing unsuitable behaviors. In general, we point out the existence of some particular situations of conflict and indiscipline, justifying an action towards the prevention of these issues, looking for alternatives to inappropriate behavior